Суть ПЦР
С помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало возможным в лабораторных условиях, по сути дела в пробирке, повторить то, что происходит с молекулой ДНК в клетке – её самокопирование (репликацию). Этот процесс может повторяться много раз, столько — сколько понадобится экспериментатору, и идёт он с очень большой скоростью. С помощью метода ПЦР в исследуемых тканях любого организма можно найти любой маленький фрагмент ДНК или РНК. Участок нуклеиновой кислоты, состоящий всего из нескольких нуклеотидов, не только можно обнаружить среди большого числа других фрагментов, но и быстро размножить его, используя принцип комплементарности.
Этапы ПЦР:
— расплетение нитей двойной цепочки ДНК с участием фермента;
— расхождение нитей;
— достройка к каждой нити, недостающую цепочку по принципу комплементарности.
Процесс репликации, или удвоения ДНК, начинается на определённых участках, так называемых стартовых блоках.
Для того чтобы процесс пошёл, необходимы праймеры – короткие фрагменты нуклеиновой кислоты, являющиеся затравкой для синтеза недостающей комплементарной нити ДНК. Праймеры представляют собой искусственно созданные последовательности нуклеотидов. Они очень короткие, в их составе входит всего до 30 нуклеотидов. Чтобы создать нужные праймеры, надо знать точную последовательность нуклеотидов того фрагмента ДНК, который предстоит размножить. Ведь нуклеотиды праймеров должны быть комплементарны нуклеотидам участка ДНК.
Двухцепочечную ДНК сначала необходимо нагреть до стоградусной температуры. При этом нуклеиновая кислота денатурирует, её нити распрямляются и расходятся друг от друга. К этим нитям присоединяют, по принципу комплементарности, искусственные праймеры. «Стартовые» участки, состоящие из двух нитей, наконец созданы. Теперь начинает действовать Taq-полимераза – бактериальный фермент с высокой устойчивостью к повышенным температурам.
Этот термоустойчивый фермент синтезирует недостающие цепочки фрагментов ДНК на каждой цепочки, полученной в результате денатурации. Процесс осуществляется in vitro. Затем ещё один прогрев до 100 градусов. Синтезированные участки ДНК вступают в следующий цикл амплификации, но теперь они являются матрицами, и на них отливаются новые фрагменты ДНК, которые далее также примут участие в процессе в роли матриц. Такова полимеразная цепная реакция, относящаяся к реакциям матричного синтеза.
Схема полимеразной цепной реакции
В итоге за три часа число копий изначального фрагмента ДНК не просто увеличится, это произойдёт в геометрической прогрессии. За двадцать пять циклов создаются 106 копий.
Они легко регистрируются визуально методами молекулярной биологии.
Матричный синтез ДНК методом полимеразной цепной реакции оказался революционным для генодиагностики. Знание последовательности нуклеотидов на исследуемом фрагменте дезоксирибонуклеиновой кислоты сыграло решающую роль при использовании этого метода.
Так как фермент ДНК-полимераза не может сама начать удвоение фрагмента ДНК, а только достраивает недостающую комплементарную цепь, то сначала происходит синтез двух праймеров. Они комплементарны последовательности нуклеотидов противоположных цепей ДНК. Праймеры примыкают к участку ДНК, выбранного для амплификации. ДНК-полимераза в направлении 5′-3′ синтезирует комплементарные цепи. Данные реакции специфичны и зависят от правильности синтезированных праймеров.
Температура в ходе процесса последовательно меняется: при 90-95 градусов выпрямляются и разделяются нити ДНК, при температуре до 60 градусов происходит присоединение праймера (так называемый отжиг), при 72 градусов идёт синтез цепей ДНК.
Термостойкий фермент ДНК-полимераза, благодаря своим свойствам не теряет активности и работает в течение всего процесса.
После 20-30 циклов, образуются огромное число копий исходного фрагмента ДНК, расположенного между праймерами. Метод ПЦР очень чувствителен и его можно использовать для анализа участков ДНК, например, из сперматозоида человека.
Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода.
Перспективы практического использования ПЦР-диагностики
В настоящее время наиболее быстро развиваются пять основных направлений генодиагностики:
диагностика инфекционных заболеваний;
диагностика онкологических заболеваний;
диагностика лейкемий и лимфом;
диагностика рака груди;
диагностика других злокачественных заболеваний;
диагностика генетических заболеваний;
идентификация личности;
судебная медицина, криминалистика;
трансплантация органов и тканей;
определение отцовства;
диагностика патогенов в пище.
Специфика метода ПЦР крови на инфекции
Анализ крови на ПЦР (PCR) обнаруживает активных инфекционных агентов и неактивных патогенов, погибших под воздействием медицинских препаратов, на любом этапе развития болезни. Такая способность обусловлена выявлением не просто возбудителя инфекции, а его генома:
- ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты) бактерий, паразитов, грибков;
- РНК (рибонуклеиновой кислоты) вирусов.
Пробирку с образцом крови, взятой у пациента, размещают в амплификаторе – реакторе, обеспечивающем последовательное нагревание и охлаждение образца. К биоматериалу добавляют реакционную смесь. В амплификаторе производится более 30 циклов смены температурного режима, каждый из которых включает 3 этапа (денатурацию, отжиг праймеров, элонгацию).
В ходе многократной реакции амплификации:
- разрываются водородные цепи макромолекул (ДНК и РНК);
- образуются комплементарные комплексы матрицы с короткими фрагментами РНК и ДНК (праймеры);
- термостойка ДНК-полимераза достраивает матричную цепь, и формирует множественные генетические копии возбудителя.
При достаточном количестве копий амплификатор дает качественно-количественную оценку обнаруженному возбудителю. Таким образом, молекулярная диагностика решает три задачи одновременно:
- обнаруживает инфекционного агента;
- дифференцирует его принадлежность (вирус, бактерия и т. д) и разновидность;
- определяет дальнейшую тактику лечения и выбор медикаментов (в соответствии с установленным заболеванием).
ПЦР крови применяют для определения вирусов и бактерий либо тяжелых паразитарных внекишечных инвазий. Генная информация является уникальной, поэтому точность исследования ПЦР практически 100%. Рolymerase Сhain Reaction определяет инфекцию даже при отсутствии активности возбудителя и выраженных симптомов болезни.
Достоинства и недостатки
К лаборатории, осуществляющей ПЦР-диагностику, предъявляются высочайшие требования в плане оборудования, тест-систем и квалификации медицинского персонала. Это высокотехнологичная лаборатория, располагающая арсеналом высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов, поэтому особых недостатков она не имеет. Разве что выдает положительный результат при отсутствии клинических проявлений и тем самым ставит лечебника перед дилеммой: стоит начинать лечение или нет?
Врач, наблюдающий пациента, начинает сомневаться в достоверности результатов тестирования, поскольку никаких признаков заболевания не видит. Но все же, учитывая высокую чувствительность ПЦР-системы, следует помнить, что она обнаруживает возбудителя даже в доклинической стадии, а положительный результат в таком случае является скорее достоинством, чем недостатком. Исходя из этого, лечащий врач должен сам принять решение о целесообразности терапии, взяв во внимание и другие аргументы «за» и «против».
Преимущества диагностики с помощью полимеразной цепной реакции очевидны:
- Высокая специфичность, достигающая 100%, обусловленная присутствием в отобранном образце частиц нуклеиновых кислот, присущих конкретному организму, но чужеродных человеку;
- Высокая производительность, ведь ПЦР – высокотехнологичная автоматизированная методика, предоставляющая возможность проведения тестирования в день забора материала и избавления, таким образом, пациента от лишних треволнений;
- ПЦР, работая над одной пробой, способна провести несколько исследований и обнаружить несколько возбудителей, если ей будет такое задание. Например, при диагностике хламидийной инфекции, где ПЦР относится к основным методам, наряду с хламидией, можно обнаружить и нейссерию (гонококк) – возбудитель гонореи. Причем, на достоверности результатов это негативно не отражается;
- Тестирование методом ПЦР выявляет опасные микроорганизмы в инкубационном периоде, когда они еще не успели нанести ощутимый вред организму, то есть, ранняя диагностика предупреждает о грядущем развитии патологического процесса, что дает возможность подготовиться к нему и принять во всеоружии.
Кроме этого, во избежание недоразумений, иной раз возникающих при диагностике, ПЦР защищает себя еще и тем, что ее результаты могут зафиксироваться (фотография, компьютер) с целью использования их в экспертных целях, если будет на то необходимость.
Нормой в ответах ПЦР считают отрицательный результат, указывающий на отсутствие фрагментов чужеродных нуклеиновых кислот, положительный ответ будет свидетельствовать о наличии инфекции в организме, цифровые значения означают состояние вируса и его концентрацию на момент тестирования.
Однако полную расшифровку анализа осуществляет врач, прошедший специальную учебу по теме «ПЦР». Пытаться же интерпретировать результаты самостоятельно не имеет никакого смысла, поскольку можно, что скорее всего и произойдет, неправильно понять и начать заранее волноваться.
Сферы применения
Самое большое распространения ПЦР-диагностика получила в медицине. С помощью нее можно определить вирусные, инфекционные, наследственные болезни, причем сделать это можно не только в активной фазе, но и сразу после заражения.
Области медицины, в которых метод полимеразной цепной реакции активно используется для диагностики:
- урология и гинекология — для обнаружения большинства венерических заболеваний (уреаплазмоз, герпес, сифилис, гонорея, гарднереллез, трихомониаз, хламидиоз, ВИЧ, микоплазмоз, папилломавирус человека, кандидоз и пр.);
- пульмонология — при туберкулезе или пневмониях бактериальной или вирусной природы;
- гастроэнтерология — при хеликобактериозе;
- в гематологии — при цитомегаловирусе, различных онковирусах крови;
- в области инфекционных болезней — для выявления дифтерии, сальмонеллеза, мононуклеоза, листериоза, гепатитов вирусного происхождения, энцефалита;
- в онкологии — для определения рака груди, лейкемии, лимфомы.
Этот метод применяют и в неонатологии, педиатрии, офтальмологии, неврологии — практически в любой отрасли медицины он оказался необходим.
На видео подробно рассказано, какие инфекции можно выявить с помощью полимеразной цепной реакции.
Большинство заболеваний, передающихся половым путем, быстро и успешно диагностируются именно благодаря ПЦР-диагностике. Кроме определения возбудителя, этот метод позволяет узнать конкретный штамм микроорганизма, что делает возможным выбор наиболее действенного препарата при лечении.
Помимо медицины способ ПЦР используется и в других сферах:
- Наука использует методику в ходе экспериментов, применяя генные мутации, устанавливая родство эволюционных веток отдельных организмов и т.д.
Как происходит сдача анализов на ПЦР
В зависимости от материала, который забирается для проведения анализа ПЦР, существует несколько обязательных правил для пациента. Кровь сдается строго натощак утром. Мочу тоже стоит сдавать утром, первую порцию. Мокрота также сдается натощак, хотя это и необязательно. Мазки сдаются в любое время суток и имеют специфические требования. Мазок из ротоглотки также следует сдавать утром до приема пищи.
Забор материала производится сертифицированным специалистом стерильными одноразовыми инструментами. Берут анализ крови на ПЦР одноразовым стерильным шприцом, из вены забирают приблизительно 1-2 мл венозной крови для выявления таких инфекций как герпес или ВПЧ (вирус папилломы человека). Мочи достаточно 10 мл, мокроты – субстанции, размером со спичечную головку.
Для каждого вида анализа ПЦР существуют свои требования:
- кровь, как говорилось выше, забирают из вены натощак;
- мочу следует сдавать утром, первую порцию. Но, если забор является срочным, то достаточно сдать мочу по прошествии 2 часов после последнего мочеиспускания. Это позволит инфекции набрать необходимую критическую массу на 1 мл для более простого обнаружения патогена;
- как берут соскоб из уретры. Первым делом обрабатывают раствором NaCl 0.9% наружное отверстие уретры. Затем, совершая циркулярные движения, зонд проводят на 2-4 см в уретру. Головку зонда, которая имеет щетинистое строение отсекают и кладут в пробирку со специальным раствором (своеобразный питательный агар для бактерий);
- из влагалища производят мазок. Предварительно убирают секрет бартолиновых желез, затем из заднего нижнего свода влагалища специальной ватной палочкой происходит забор материала. При видимых патологических изменениях во влагалище мазок следует брать непосредственно на поврежденном участке;
- как проводят соскоб из цервикального канала у женщин. Удалив слизь из наружных половых путей, зонд на 0,5 – 1,5 см вводят в шейку матки, совершают циркулярное движение и, не касаясь стенок влагалища, удаляют зонд из половых путей. Затем совершают действия, аналогичные соскобу из уретры;
- из ротоглотки забор происходит натощак. Придерживая кончик языка, зондом производят мазок с задней стенки глотки, по миндалинам или по небным дужкам. Не соприкасаясь со слизистой ротовой полости и зубами, зонд выводится и отправляется на пцр-исследование;
- из конъюнктивы, предварительно очистив физиологическим раствором гнойные выделения, производят соскоб слизистой нижнего века от латерального к медиальному краю. Веко при этом придерживается медицинским работником во избежание соприкосновения зонда со слизистой глаза и ресницами.
Расшифровка результатов ПЦР
Расшифровка анализов ПЦР очень просто (см примерный бланк выше). Существует положительный и отрицательный результаты исследования. Положительный означает, что инфекция в организме есть, но это не должно наводить страх на пациента. Наоборот, это значит, что теперь можно начать лечение и вовремя остановить патоген. Отрицательный результат, соответственно, показывать отсутствие инфекции в организме.
Также не стоит забывать о ложноположительных/ложноотрицательных результатах. В медицине золотым стандартом является три одинаковых результата подряд в независимых клиниках. Стоит помнить, что в разных клиниках сама КДЛ (клинико-диагностическая лаборатория) может быть одна. То есть, здания и названия будут разные, но все анализы отправляются в одну лабораторию, связывающую эти клиники. Поэтому, получив результат в одной клинике, для того, чтобы удостовериться в правильности данного результата, стоит обратиться еще в две клиники и узнать, не сдают ли они результаты в одну и ту же КДЛ.
О результатах и ценах
Результаты исследования можно получить на следующий день. Количественный показатель, иначе, число полученных копий инфекционного агента, указывается редко. В большинстве случаев пациент получает бланк с качественной интерпретацией результата. Варианты могут быть:
- «обнаружено» или «положительно» — наличие инфекционного заболевания;
- «не обнаружено» или «отрицательно» — отсутствие заражения.
Положительный результат при отсутствии выраженных проявлений болезни свидетельствует о латентном бессимптомном течении инфекции или пребывании возбудителя в стадии инкубации. Исследование относится к средней ценовой категории.
В клиниках Москвы и других крупных городов стоимость определения одного вида инфекции варьируется от 300 до 500 руб. Комплексный анализ полимеразной цепной реакции ПЦР-12, как правило, обходится дешевле, чем проверка на каждый возбудитель отдельно.
